Neurotransmission an der neuromuskulären Endplatte von Säugetieren erfolgt durch Ausschüttung von Acetylcholin (ACh) aus motorischen Nerven in den synaptischen Spalt und verursacht letztendlich Muskelkontraktion im angesteuerten Muskel. Der Signalstoff Agrin, welcher ebenfalls vom Motornerv sekretiert wird, ist hauptverantwortlich für die postsynaptische Differenzierung der Muskelfasern und bewirkt die räumliche Konzentration der Rezeptoren für den Neurotransmitter Acetylcholin (AChR) in einem kleinen - meist zentralen - Areal der Faser unterhalb des Ansatzpunkt der Motornervendigung. Nach intensiver Beforschung sind die Endeffekte von Agrin auf Muskelfasern gut dokumentiert und viele involvierte Moleküle bekannt. Trotzdem ist die Rolle des subsynaptischen Mikrotubuli-Zytoskeletts beim Transport, bei der Membraninsertion und bei der Konzentrierung von AChR-Molekülen wenig erforscht und die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, welche ein Mikrotubuli-Netzwerk unterhalb der Synapse etablieren, sind grossteils unbekannt. Im Zuge meiner Doktorarbeit untersuchte ich daher neue Aspekte der agrin-induzierten biochemischen Signalübertragung im Muskel und deren zellbiologischen Konsequenzen auf das Mikrotubuli-Zytoskelett. Gerichteter intrazellulärer Vesikel-Transport erfolgt generell entlang von polaren Cytoskelettstrukturen, ein grosser Teil davon entlang von Mikrotubuli - kurzlebige Cytoskelettfilamente, deren dynamischeres „Plus-Ende“ beständig zwischen Wachsen und Schrumpfen wechselt. Bestimmte Stimuli jedoch können über Signaltransduktions-kaskaden dazu führen, dass die schnell wachsenden Plus-Enden der Mikrotubuli mithilfe assoziierter Proteine (+TIP-Proteine) längerfristig an die Innenseite der Zellmembran oder an das Actinzytoskelett binden und dort verankert werden („Microtubule Capture“). Dieser Vorgang stabilisiert die betreffenden Mikrotubuli und verlängert ihre Halbwertszeit – die stabilisierten Microtubuli dienen der Zelle in weiterer Folge als gerichtete Transportrouten. In meiner Doktorarbeit konnte ich zeigen, dass die Acetylcholinrezeptorreiche postsynaptische Zentralregion der Muskelfasern von einem dichten Netzwerk von Microtubuli umgeben ist, einige dieser Microtubuli sind zudem durch post-translationale Modifikationen weiter stabilisiert. Weiters konnte ich demonstrieren, dass der Botenstoff Agrin im Muskel eine biochemische Signaltransduktions-kaskade auslöst, welche die PI3-Kinase aktiviert und an deren Ende GSK3β durch Phosphorylierung lokal inaktiviert wird. Da viele der zuvor erwähnten +TIP-Proteine, zum Beispiel CLASP2, durch GSK3β negativ reguliert sind, ist eine lokalisierte Inaktivierung von GSK3β zentrale Voraussetzung dafür, dass +TIP-Proteine an Mikrotubuli Plus-Enden binden können und somit zur Etablierung von stabilen Mikrotubuli-Filamenten beitragen. Nach agrin-induzierter Inaktivierung von GSK3β bindet CLASP2 an Mikrotubuli Plus-Enden und befestigt diese am Zellkortex in der AChR-reichen Region von Myotuben in Wechselwirkung mit LL5β - welches von PI3K zur synaptischen Membran rekrutiert wird. Die betreffenden Mikrotubuli werden dadurch stabilisiert und können der Zelle als intrazelluläre Transportrouten für postsynaptisches Material wie etwa AChRs und Strukturproteine dienen. Funktionsverändernde Mutationen beteiligter Moleküle sowie pharmakologische Eingriffe in den PI3K/GSK3β-Signalweg zeigten allesamt Effekte auf die lokale Konzentrierung von AChRs, die mit oben angeführter Kausalkette konsistent sind: Die Depolymerisierung von Microtubuli, die Hemmung der PI3-Kinase, der Verlust des Clasp2-Gens, die shRNAvermittelte Unterdrückung der LL5β-Expression sowie die Hyperaktivierung von GSK3β führten jeweils zu reduzierter Grösse der AChR-Ansammlungen, während die Hemmung von GSK3β die Grösse der AChR-Ansammlungen erhöhte. Zusammengefasst trägt agrin-induzierte und +TIP-vermittelte Befestigung von Mikrotubuli an der subsynaptischen Membran zur fokalen Insertion und zum lokalen Konzentration von AChRs bei. Abstract Neurotransmission at the neuromuscular synapse of mammals occurs after secretion of acetylcholine (ACh) from the motor nerve into the synaptic cleft and ultimately results in contraction of the target muscle. The signaling molecule agrin, which is also secreted by the motoneuron, is the main organizer of postsynaptic differentiation and induces the clustering of receptors for the neurotransmitter acetylcholine (AChR) in a small – mostly central – area of the myofiber directly underneath the motoneuron terminal bouton. After intense research, the end results of agrin-induced differentiation are well documented and many involved molecules are known. Nevertheless, the role of the subsynaptic microtubule (MT) cytoskeleton in the process of AChR transport, insertion and clustering and the molecular mechanisms of the establishment of such a microtubule network are poorly defined. During my thesis, I analyzed new aspects of agrin-induced biochemical signaling and the cell biological consequences for the microtubule cytoskeleton. Targeted intracellular transport of vesicles generally occurs along polar cytoskeletal structures, a major part along microtubules – cytoskeletal filaments that are normally short-lived with a highly dynamic “plus-end”, which alternates between periods of growing and shrinking. However, certain stimuli induce signal transduction cascades which result in the “capture” of microtubule plus-ends at the cell cortex by interaction of plus-end binding proteins (+TIPS) with factors that localize to the cortex or the actin cytoskeleton. This event stabilizes microtubules and can drastically increase their lifetime – affected microtubule then serve the cell as stable, directional transport tracks. During my thesis, I could show that the AChR-rich postsynaptic membrane encompasses a dense subsynaptic MT network, with some MTs further stabilized by post-translational modifications. In addition, I could demonstrate that agrin induces PI3 kinase signaling in muscle, which ultimately inactivates GSK3β by phosphorylation. Since many of the former mentioned +TIP proteins are negatively regulated by GSK3β, localized inactivation of GSK3β is crucial to enable +TIP-mediated microtubule capture and establishment of stable transport tracks at sites with elevated protein requirements such as the postsynaptic membrane. +TIP proteins, in particular Clasp2, then capture MTs at the cell cortex within AChR-rich sites by interacting with the membrane PIP3-sensor LL5β and thus establish intracellular transport routes for focal transport of postsynaptic material like AChRs and structural proteins towards the synapse. Mutants of involved molecules as well as pharmacologic manipulation of the PI3K/GSK3β-axis displayed effects on the clustering of AChRs, which are fully consistent with the aforementioned chain of events: Microtubule depolymerization, inhibition of PI3K, loss of the clasp2 gene, shRNAmediated repression of LL5β expression and hyper-activation of GSK3β lead to reduced AChR clustering, while inhibition of GSK3β elevates AChR clustering. Taken together, agrin-induced and +TIP-mediated MT capture at the subsynaptic muscle membrane contributes to focal insertion and clustering of AChRs at the neuromuscular junction.