Efficient clinical xenotransplantation requires multi-modified pigs that coexpress several xenoprotective transgenes and carry inactivation mutations in several endogenous genes. Great progress has been achieved in recent years in identifying means of inhibiting the hyperacute and to some extent the acute vascular rejection. The main hurdle at the moment is to obtain high and ubiquitous expression of all complement regulatory genes and to combine all the necessary modifications into a single genotype. In this work different approaches are shown how several xenoprotective transgenes can be combined at one genomic locus. One approach is based on the use of a large bacterial artificial chromosome (BAC) construct, carrying the genomic sequence of the complement regulatory gene human CD55 onto which further coagulation regulatory (human thrombomodulin) and T-cell regulatory genes (LEA29Y) or anti-apoptotic and anti-inflammatory genes such as human A20 and human heme oxygenase 1 (HO1) were added. This approach allows cotransfection of several xenogenes but does not allow predetermination of the genomic integration site(s). The constructs made in this work were subsequently used for cotransfection experiments together with BAC or PAC constructs carrying the genomic sequence of CD46 or CD59 to obtain either a human artificial chromosome (HAC) that carries several xenoprotective transgenes or multi-transgenic cells that express a battery of xenoprotective transgenes. Although it was not possible to create a functional HAC, a preexisting HAC could be successfully transferred via microcell mediated chromosome transfer from human into porcine cells. This method could in principle be used to transfer whole human chromosomal loci encoding xenoprotective genes into porcine cells. However, the cotransfection experiments delivered a large number of cell clones expressing a wide range of xenoprotective transgenes. Cells revealing the highest expression levels of the complement regulatory genes were used for somatic cell nuclear transfer and two founder animals were obtained. One animal revealed CD46 and CD55 expression and one multi-transgenic founder animal expressed CD46, CD55, CD59, HO1 and A20. Analysis of different tissues showed expression of the transgenes in almost all organs. Moreover, a complement-mediated lysis assay revealed complete protection of the five-fold transgenic cells. Subsequently, these cells were further modified by a knockout of the GGTA1 gene. An additional approach to obtain transgenic animals suitable for xenotransplantation was based on targeted placement of a HO1 construct at the permissive porcine ROSA26 locus. A transgenic animal was obtained via somatic cell nuclear transfer which showed ubiquitous expression of HO1. To investigate whether further transgenes could be added at the same locus by 'gene-stacking', a retargeting vector was generated to place a CAG-driven CD55 minigene adjacent to HO1. By this approach several xenogenes can be precisely placed “step by step” at a single genomic locus known to support expression. This is one of the first examples showing that efficient placement of several xenogenes can be achieved and how multi-modified pigs can be generated in a single step. Moreover, preselection of cells resulted in animals revealing expression levels which exceed the best published results. The approach used avoids segregation of transgenes during breeding, thereby drastically reducing the number of experimental animals required. Together with the knockout of the major xeno antigen, organs from these animals will bring xenotransplantation closer to the clinic. ; Für eine effiziente klinische Xenotransplantation werden mehrfach transgene Schweine benötigt, die sowohl protektive Xenogene exprimieren als auch eine Inaktivierung von mehreren porzinen Genen aufweisen. In den letzten Jahren wurde ein großer Fortschritt darin erzielt, die hyperakute Abstoßungsreaktion sowie auch teilweise die akut vaskuläre Abstoßungsreaktion zu verhindern. Die Hauptaufgabe besteht zurzeit darin, eine hohe und ubiquitäre Expression aller komplement-regulatorischen Gene zu erhalten und alle Modifikationen in einem einzigen Schwein zusammenzufassen. In dieser Arbeit werden verschiedene Ansätze beschrieben, wie mehrere protektive Xenogene an einem genomischen Lokus kombiniert werden können. Eine dieser Möglichkeiten besteht in der Verwendung eines großen künstlichen Bakterienchromosoms (BAC), das die genomische Sequenz des komplement-regulatorischen Gens CD55 trägt und worauf weitere Gene wie das humane, blutgerinnungs-hemmende Gen Thrombomodulin und das T-Zell-regulatorische Gen LEA29Y bzw. die humanen anti-apoptotischen sowie anti-inflammatorischen Gene A20 und Häm-oxygenase 1 (HO1) hinzugefügt wurden. Durch diesen Ansatz können zwar mehrere Xenogene gleichzeitig transfiziert werden, jedoch besteht keine Möglichkeit die chromosomale Integrationsstelle vorab festzulegen. Die in dieser Arbeit hergestellten Konstrukte wurden zusammen mit weiteren BAC bzw. PAC Konstrukten, welche die genomische Sequenz von humanem CD46 oder humanem CD59 trugen, transfiziert um einerseits künstliche humane Chromosomen (HAC) zu erzeugen, die eine Vielzahl an xeno-protektiven Genen tragen oder multi-transgene Zellen zu erzeugen, die eine große Anzahl an xeno-protektiven Genen gleichzeitig exprimieren. Obwohl die Neubildung eines HACs nicht erreicht werden konnte, so konnte ein bereits bestehendes HAC durch den mikrozellen-vermittelten Chromosomentransfer erfolgreich von humanen in porzine Zellen übertragen werden. Diese Methode kann grundsätzlich auch dazu verwendet werden um komplette menschliche Chromosomen, die eine Vielzahl von xeno-protektiven Genen enthalten, in porzine Zellen zu übertragen. Jedoch lieferten die Kotransfektionsexperimente eine große Anzahl an Zellklonen, die mehrere xeno-protektive Gene gleichzeitig exprimierten. Zellen mit den höchsten Expressionsniveaus der komplement-regulatorischen Gene wurden für den somatischen Kerntransfer verwendet. Daraus gingen zwei Gründertiere hervor, die eine hohe CD46 und CD55 Expression aufwiesen bzw. ein multi-transgenes Gründertier mit einer Expression von CD46, CD55, CD59, HO1 und A20. Die Analyse unterschiedlicher Gewebe zeigte die Expression der Transgene in fast allen Organen. Zusätzlich zeigte ein Test mit humanem Serum den vollständigen Schutz der multi-transgenen Zellen vor der komplement-vermittelten Zelllyse. Diese Zellen wurden darauffolgend durch eine Inaktivierung des GGTA1 Gens weiter modifiziert. Ein weiterer Ansatz um transgene Tiere zu erhalten, die für die Xenotransplantation geeignet sind, bestand aus einer zielgerichteten Platzierung eines HO1 Konstruktes in dem gut zugänglichen porzinen ROSA26 Lokus. Über den somatischen Kerntransfer wurde ein transgenes Tier erzeugt, das eine ubiquitäre Expression von HO1 aufwies. Um herauszufinden, ob weitere Transgene am gleichen Lokus platziert werden könnten, wurde ein weiterer Vektor kloniert, der es erlaubt ein CAG-CD55 Minigen neben HO1 zu platzieren. Durch diesen Ansatz können mehrere Xenogene präzise nacheinander an einem einzigen genomischen Lokus platziert werden der eine Expression dieser Gene erlaubt. Dies ist eines der ersten Beispiele welches zeigt, dass mehrere Xenogene sehr effizient an einem Lokus platziert und wie multi-modifizierte Schweine in einem einzigen Schritt erzeugt werden können. Durch die Vorauswahl der Zellen konnten Tiere geschaffen werden, deren Expressionslevel die besten veröffentlichen Ergebnisse übertreffen. Der verwendete Ansatz verhindert die Segregation der Transgene während der Züchtung wodurch sich die Anzahl der Versuchstiere drastisch verringert. In Verbindung mit der Inaktivierung des wichtigsten Xenoantigens, werden die Organe dieser Tiere die Xenotransplantation näher an die klinische Umsetzung heran bringen.