The regio- and stereoselective synthesis of chiral molecules with multiple stereocenters is extremely demanding, whereas nature selectively generates highly complex products with ease. In polyketide biosynthesis, for example, achiral precursors are repetitively assembled giving ketone intermediates. Stereocenters are introduced optionally by the enzymatic reduction of the newly formed carbonyl group in each elongation step. The complexity of the resulting hydroxyketo products often renders selective access in vitro very challenging. In this thesis, a versatile approach for the preparation of hydroxyketoesters equal to triketides that are reduced in one out of two possible positions is presented. Regio- and stereoselectivity was controlled by the use of alcohol dehydrogenases (ADHs). The synthesis of δ-hydroxy-β-ketoesters was accomplished by reductions catalyzed by ADHs known to reduce a β,δ diketoester stereoselectively in δ-position. To generate β-hydroxy-δ-ketoesters a novel strategy was developed: Here, the same enzymes were used to oxidize a β,δ dihydroxyester regioselectively in δ-position. Thus, the absolute configuration was established by both the stereochemical preferences of the ADH and the relative configuration of the diol precursor. ADH-catalyzed reactions consume stoichiometric amounts of the nicotinamide cofactor in either reduced [NAD(P)H] or oxidized form [NAD(P)+]. Therefore, the in situ regeneration of the cofactor is recommended to ensure an economical cofactor supply. For the regeneration of NAD(P)H the frequently used glucose/glucose dehydrogenase regeneration system was employed. A comparably well-established system to regenerate both NAD+ and NADP+ has not been available, although ADH-catalyzed oxidations particularly require cofactor regeneration as a thermodynamic driving force. In this thesis, an oxygen-dependent regeneration system using naphthoquinone lawsone as mediator was established. Here, the enzymatic reduction of lawsone catalyzed by the NAD(P)H-dependent reductase NfsB from E. coli initiates a redox cycle that is closed by the autoxidation of the naphthohydroquinone by molecular oxygen from ambient air. The regeneration system proved to be easy and widely applicable and was a key achievement to enable the successful implementation of ADH oxidaition to synthesize β-hydroxy-δ-ketoesters selectively. All four stereo- and regioisomers of the mono-reduced δ,β diketohexanoate and seven out of eight of the possible δ-hydroxy-β-ketoesters and β hydroxy-δ-ketoesters with an additional γ methyl group were obtained. The absolute configuration of each product was confirmed by VCD analysis. The synthesized hydroxyketoesters were used as reference compounds for the HPLC analysis of the reduction products of carbonyl reductase S1 from Candida magnoliae with either an N terminal or a C-terminal His-tag. The results show that the stereo- and regiochemical behavior in reduction of diketohexanoates depends on the position of the polyhistidine-tag. This can be explained with the intrinsic coexistence of different binding modes for the same substrate. One binding mode is strongly favored in the N-terminal tagged enzyme, while another one becomes more important if the generally preferred binding mode was obstructed by the C terminal modification. The identification of the unprecedented selectivity associated with this binding model was possible, because the β-hydroxy regioisomer could be characterized in the product mixture with help of the reference compounds. Possibly, such “hidden” binding modes contribute to enzyme promiscuity and preserve the plethora of natural products with a limited number of enzymes. ; Die regio- und stereoselektive Synthese chiraler Moleküle mit mehreren Stereozentren ist äußerst anspruchsvoll, wobei die Natur solch hochkomplexe Substanzen mit Leichtigkeit produziert. In der Polyketidsynthese werden beispielsweise zunächst achirale Bausteine wiederholt miteinander zu Ketonzwischenprodukten verknüpft. Nach jedem Kettenverlängerungsschritt werden Stereozentren optional durch die Reduktion der neu gebildeten Carbonylgruppe eingeführt. Aufgrund ihrer Komplexität stellt der in-vitro-Zugang zu den entstehenden Hydroxyketo-Produkten häufig eine große Herausforderung dar. In dieser Arbeit wird ein variabler Ansatz zur Gewinnung von Hydroxyketoestern vorgestellt. Die erhaltenen Produkte entsprechen Triketiden, die in einer der zwei möglichen Positionen reduziert wurden. Die Regio- und Stereoselektivität wurde dabei durch den Einsatz von Alkoholdehydrogenasen (ADHs) gesteuert. Die Synthese der δ-Hydroxy-β-ketoester gelang durch Reduktionen von β,δ-Diketoestern, katalysiert durch ADHs, die bekannt dafür sind, diese regioselektiv in δ-Position zu reduzieren (Abbildung 1, links). Für die Darstellung von β-Hydroxy-δ-ketoestern wurde eine neue Strategie entwickelt. Es wurden die gleichen Enzyme genutzt, um einen β,δ-Dihydroxyester regioselektiv in δ-Position zu oxidieren. Dabei wurde die absolute Konfiguration sowohl durch die stereochemischen Präferenzen der ADH als auch durch die relative Konfiguration der Diol-Vorstufe bestimmt. ADH-katalysierte Reaktionen verbrauchen stöchiometrische Mengen des Nikotinamid- Cofaktors in seiner reduzierten [NAD(P)H] oder oxidierten [NAD(P)+] Form. Daher ist es empfehlenswert, den Cofaktor in situ zu regenerieren, um eine ökonomische Versorgung zu gewährleisten. Zur Regenerierung von NAD(P)H wurde das häufig verwendete Glucose/Glucose-Dehydrogenase-System verwendet. Ein ähnlich gut etabliertes Regenerierungssystem für sowohl NAD+ als auch NADP+ war nicht bekannt, obwohl insbesondere ADH-katalysierte Oxidationen auf die Regenerierung des Cofaktors als thermodynamische Triebkraft angewiesen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zu diesem Zweck ein sauerstoffabhängiges Regenerierungssystem etabliert, das als Mediator das Naphthochinon Lawson nutzt. Dabei initiiert die Reduktion von Lawson durch die NAD(P)Habhängige Reduktase NfsB aus E. coli einen Redox-Zyklus, der durch die Autoxidation des entstandenen Naphthohydrochinon durch molekularen Sauerstoff aus der Umgebung geschlossen wird (Abbildung 2). Das Regenerierungssystem erwies sich als einfach und universell einsetzbar und stellte einen der entscheidenden Schritte in der Implementierung der ADH-katalysierten Oxidation zur selektiven Synthese von β-Hydroxy-δ-ketoestern dar. Alle vier Stereo- und Regioisomere des einfach reduzierten δ,β-Diketohexanoats und sieben der acht möglichen δ-Hydroxy-β-keto- und β-Hydroxy-δ-ketoestern mit einer zusätzlichen Methylgruppe in γ-Position wurden erhalten. Die Stereochemie der Produkte wurde mittels Schwingungs-Zirkulardichroismus-Analyse bestätigt. Die synthetisierten Hydroxyketoester fanden Verwendung als Referenzen für die HPLCbasierte Analyse der Reduktionsprodukte der Carbonyl-Reduktase S1 von Candida magnoliae mit entweder N-terminalen oder C-terminalen His-Tag. Die Ergebnisse zeigen, dass die Stereound Regiochemie der Reduktionsprodukte von Diketohexanoaten von der Position des His-Tags abhängig sind. Dies lässt sich durch die Koexistenz zweier verschiedener Bindungsmodi für das gleiche Substrat erklären. In dem Enzym mit N-terminalen His-Tag ist einer der Bindungsmodi so stark bevorzugt, dass der andere erst zur Geltung kommt, wenn die Bindung des Substrats im normalerweise bevorzugten Modus durch die C-terminale Modifizierung geschwächt wird. Die mit diesem Bindungsmodel verbundene unbekannte Selektivität des Enzyms konnte nur identifiziert werden, da das β-Hydroxy-Regioisomer mit Hilfe der Referenzen im Produktgemisch charakterisiert werden konnte. Möglicherweise tragen derartige „versteckte“ Bindungsmodi zur Promiskuität von Enzymen und dem Erhalt der Vielzahl an Naturstoffen bei einer begrenzten Anzahl von Enzymen bei.