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Analyse der Low-Density-Lipoproteine (LDL) : kann die LFE die UZ-Fraktionierung von LDL ersetzen? ; Lipoprotein electrophoresis and ultracentrifugation for LDL subfraction analysis
Koronare Herzkrankheit und Schlaganfall sind die fatalen Endpunkte der Atherosklerose. Unter den Risikofaktoren nehmen vor allem Cholesterin und Neutralfette transportierende Lipoproteine eine herausragende Stellung ein. Lipoproteine können in Fraktionen und Subfraktionen getrennt werden. In vielen epidemiologischen Studien war gezeigt worden, dass von den Low-Density-Lipoproteinen (LDL) besonders die Subfraktionen mit kleinen, dichten Partikeln mit einem erhöhten Risiko für Herz-Kreislauferkrankungen assoziiert sind. Um diese besonders atherogenen LDL-Partikel diagnostisch zu erfassen, ist eine Auftrennung in LDL-Subfraktionen erforderlich. Hierzu dient die analytische Ultrazentrifuge (UZ) als das (zeitaufwendige) Standardverfahren. In dieser Arbeit wurde untersucht, in wieweit eine vergleichbare Auftrennung der LDL aus dem Serum durch eine Gradientengel-Elektrophorese (LFE) möglich ist. Mittels der LFE werden die Lipoproteine durch die kleinen Unterschiede ihrer Wanderungsgeschwindigkeiten auf dem Gradientengel der Grösse nach getrennt. Entsprechend den Fraktionen LDL1 bis LDL6 zunehmender Dichte aus der UZ-Analyse wurden die LDL-Fraktionen in der LFE ebenfalls in sechs Subfraktionen unterteilt. Da die Unterschiede der Rs-Werte innerhalb der LDL-Fraktion zwischen LDL1 und LDL6 klein sind, ist es notwendig, einen Standard aus UZ-LDL1 und UZ-LDL6 jeweils rechts und links vom Patientenserum aufzutragen. Die Zuordnung der LDL-Hauptfraktion für das Serum erfolgte anhand seines Rs-Wertes relativ zu den gemittelten Rs-Werten für die UZ-Standard-Banden der benachbarten Spuren. Die densitometrische Bestimmung der Rs-Werte wurde mittels des Software-Programms Scan-Pack 3.0 vorgenommen. Von 82 Patientenseren wurden die jeweils mit UZ und mit LFE bestimmten LDL-Subfraktionen miteinander verglichen. Als Bezugsgrössen zur Ermittlung der UZ-LDL-Hauptfraktionen dienten dabei die fraktionsweise gemessenen ApoB- und Chol-Werte. Bei 28 Seren ergab sich in den UZ-Subfraktionen keine Hauptfraktion, sondern eine annähernde Gleichverteilung der Messparameter. Eine Zuordnung entfiel daher für diese Seren. Als UZ-Hauptfraktion wurden dann nur solche Proben mit ApoB- bzw. Chol-Werten > 23%, > 25% bzw. > 27% zugelassen. Bei einem cut-off von 23% ApoB wurde für 56% der Proben eine Übereinstimmung mit den Ergebnissen der LFE gefunden, bei > 25% stimmten 61% überein und bei > 27% wiesen 64% eine gleiche Zuordnung hinsichtlich der markanten LDL-Subfraktionen auf. Die gleichartige Auswertung anhand der Chol-Werte zeigte den gleichen Trend, die Übereinstimmung beider Verfahren war aber etwas geringer. Wertet man nach einem Modus aus, bei dem LDL1 und LDL2 zu einer Fraktion weniger atherogener Partikel, LDL3 und LDL4 als Zwischenfraktion und schließlich LDL5 und LDL6 als hochatherogene Subfraktion jeweils zusammengezogen bei einem cut-off von 33% ApoB zum Vergleich mit den LDL-Fraktionen der LFE gebracht werden, resultiert eine Äquivalenz von 72% der Subfraktionen. Die LFE ermöglicht es, bei sorgfältiger Arbeitsweise aus nativen Seren ein Lipidprofil durch Aufspaltung in die VLDL, IDL sowie die LDL- und HDL-Subfraktionen zu erstellen. Darüber hinaus ermöglicht die LFE auch die Detektion und (halbquantitative) Bestimmung von Banden, die vor LDL1 und hinter LDL6 auftreten und in der UZ zum Teil mit diesen zusammen bestimmt werden. Hier liefert die LFE verglichen mit der UZ zusätzliche wertvolle Informationen. ; Coronary heart disease (CHD) and stroke are the final points of arteriosclerosis. Among the risk factors - e.g. age, weight, smoke, hypertony, diabetes - are especially important lipoproteins, which carry cholesterol and triglycerides, because their qualitative and quantitative measurement gives a risk predictor for arteriosclerosis. Lipoproteins are a heterogeneous family of particles of different size, density, and composition. Their different properties allow their separation in fractions and subfractions. Yet, many epidemiological studies showed that of the LDL-particles especially subfractions with small, dense particles are associated with high risk for CHD. For the diagnostic assessment of these arteriogenic LDL-particles a separation in LDL-subfractions is required. Standard procedure is the - time consuming - analytical ultracentrifugation (UC). In this work we evaluated the possibility to get comparable results by lipoprotein separation, starting with native serum samples, via electrophoresis on gradient polyacrylamide gels (LFE) (Zaxis Inc.). Corresponding to the fractions LDL1 to LDL6 with increasing density from the UC-analysis the LDL fraction of the LFE was divided into 6 subfractions. Because the Rs-differences between these LDL1 to LDL6 subfractions within the LDL-fraction are small, it is necessary to take as a standard a mixture of UC-LDL1 and UC-LDL6 and place it at both sides of each analytical lane with a sample of native patient serum. For correlation of the LFE main serum fraction we took the mean of the two Rs-values of the neighbouring standard lanes. Yet, as an essential prerequisite and a basis of our procedure we could show that LDL-fractions 1 to 6 are placed separately on lanes forming peaks in the same order as the UC- LDL fractions, giving an appearance like a staircase. In this work we compared LDL subfractions in samples of 82 patient sera separated by LFE with the same ones separated by UC. As a basis for determination of the UC-LDL main fraction were used the Apolipoprotein B (ApoB)- or Cholesterol (Chol)-values, measured in each fraction separately. In 28 samples (ApoB), no main fraction could be found, but nearly equal amounts of ApoB- and Chol-values in the subfractions. As UC main fraction we took only those with AopB- or Chol-values > 23%, > 25% and > 27%, resp. Using a cut-off of 23% ApoB we found an agreement with the main peak of the LFE in 56% of the samples (cut-off > 25%: 61% correlation; cut-off > 27%: 64% correlation). Forming only three subfractions, LDL1 and LDL2 together as less arteriogenic particles, LDL3 and LDL4 as a mean fraction and LDL5 and LDL6 together as highly arteriogenic particles, using a cut-off of 33% for each, we observed equivalence in 72% of the samples. The same procedure using Chol-values showed a similar tendency, but the correspondence between UC and LFE subfractions was lower. Electrophoretic separation of lipoproteins on polyacrylamide gels, starting with untreated samples of native sera, yields in relative short time a profile of lipids by separation into VLDL, IDL, LDL, and HDL fractions and subfractions, resp. When worked out carefully, LFE provides LDL subfractions with comparable precision to UC. Yet, LFE is able to identify those patients which possess normal values for LDL-Chol and HDL-Chol, and normal total Chol/LDL-Chol-quotients, respectively, but live in danger to develop endothelial dysfunction or arteriosclerosis because their LDL profile is unhealthy. They can be brought under medical attendance to a moderate prevention (change of lifestyle, healthy food, weight reduction, physical exercises). For high risk patients it should be of major importance to test variations by lipid reducing substances by monitoring the LDL profile, especially for reducing small dense LDL. For this goal, extensive clinical studies would be required.
Analyse der Low-Density-Lipoproteine (LDL) : kann die LFE die UZ-Fraktionierung von LDL ersetzen? ; Lipoprotein electrophoresis and ultracentrifugation for LDL subfraction analysis
Koronare Herzkrankheit und Schlaganfall sind die fatalen Endpunkte der Atherosklerose. Unter den Risikofaktoren nehmen vor allem Cholesterin und Neutralfette transportierende Lipoproteine eine herausragende Stellung ein. Lipoproteine können in Fraktionen und Subfraktionen getrennt werden. In vielen epidemiologischen Studien war gezeigt worden, dass von den Low-Density-Lipoproteinen (LDL) besonders die Subfraktionen mit kleinen, dichten Partikeln mit einem erhöhten Risiko für Herz-Kreislauferkrankungen assoziiert sind. Um diese besonders atherogenen LDL-Partikel diagnostisch zu erfassen, ist eine Auftrennung in LDL-Subfraktionen erforderlich. Hierzu dient die analytische Ultrazentrifuge (UZ) als das (zeitaufwendige) Standardverfahren. In dieser Arbeit wurde untersucht, in wieweit eine vergleichbare Auftrennung der LDL aus dem Serum durch eine Gradientengel-Elektrophorese (LFE) möglich ist. Mittels der LFE werden die Lipoproteine durch die kleinen Unterschiede ihrer Wanderungsgeschwindigkeiten auf dem Gradientengel der Grösse nach getrennt. Entsprechend den Fraktionen LDL1 bis LDL6 zunehmender Dichte aus der UZ-Analyse wurden die LDL-Fraktionen in der LFE ebenfalls in sechs Subfraktionen unterteilt. Da die Unterschiede der Rs-Werte innerhalb der LDL-Fraktion zwischen LDL1 und LDL6 klein sind, ist es notwendig, einen Standard aus UZ-LDL1 und UZ-LDL6 jeweils rechts und links vom Patientenserum aufzutragen. Die Zuordnung der LDL-Hauptfraktion für das Serum erfolgte anhand seines Rs-Wertes relativ zu den gemittelten Rs-Werten für die UZ-Standard-Banden der benachbarten Spuren. Die densitometrische Bestimmung der Rs-Werte wurde mittels des Software-Programms Scan-Pack 3.0 vorgenommen. Von 82 Patientenseren wurden die jeweils mit UZ und mit LFE bestimmten LDL-Subfraktionen miteinander verglichen. Als Bezugsgrössen zur Ermittlung der UZ-LDL-Hauptfraktionen dienten dabei die fraktionsweise gemessenen ApoB- und Chol-Werte. Bei 28 Seren ergab sich in den UZ-Subfraktionen keine Hauptfraktion, sondern eine annähernde Gleichverteilung der Messparameter. Eine Zuordnung entfiel daher für diese Seren. Als UZ-Hauptfraktion wurden dann nur solche Proben mit ApoB- bzw. Chol-Werten > 23%, > 25% bzw. > 27% zugelassen. Bei einem cut-off von 23% ApoB wurde für 56% der Proben eine Übereinstimmung mit den Ergebnissen der LFE gefunden, bei > 25% stimmten 61% überein und bei > 27% wiesen 64% eine gleiche Zuordnung hinsichtlich der markanten LDL-Subfraktionen auf. Die gleichartige Auswertung anhand der Chol-Werte zeigte den gleichen Trend, die Übereinstimmung beider Verfahren war aber etwas geringer. Wertet man nach einem Modus aus, bei dem LDL1 und LDL2 zu einer Fraktion weniger atherogener Partikel, LDL3 und LDL4 als Zwischenfraktion und schließlich LDL5 und LDL6 als hochatherogene Subfraktion jeweils zusammengezogen bei einem cut-off von 33% ApoB zum Vergleich mit den LDL-Fraktionen der LFE gebracht werden, resultiert eine Äquivalenz von 72% der Subfraktionen. Die LFE ermöglicht es, bei sorgfältiger Arbeitsweise aus nativen Seren ein Lipidprofil durch Aufspaltung in die VLDL, IDL sowie die LDL- und HDL-Subfraktionen zu erstellen. Darüber hinaus ermöglicht die LFE auch die Detektion und (halbquantitative) Bestimmung von Banden, die vor LDL1 und hinter LDL6 auftreten und in der UZ zum Teil mit diesen zusammen bestimmt werden. Hier liefert die LFE verglichen mit der UZ zusätzliche wertvolle Informationen. ; Coronary heart disease (CHD) and stroke are the final points of arteriosclerosis. Among the risk factors - e.g. age, weight, smoke, hypertony, diabetes - are especially important lipoproteins, which carry cholesterol and triglycerides, because their qualitative and quantitative measurement gives a risk predictor for arteriosclerosis. Lipoproteins are a heterogeneous family of particles of different size, density, and composition. Their different properties allow their separation in fractions and subfractions. Yet, many epidemiological studies showed that of the LDL-particles especially subfractions with small, dense particles are associated with high risk for CHD. For the diagnostic assessment of these arteriogenic LDL-particles a separation in LDL-subfractions is required. Standard procedure is the - time consuming - analytical ultracentrifugation (UC). In this work we evaluated the possibility to get comparable results by lipoprotein separation, starting with native serum samples, via electrophoresis on gradient polyacrylamide gels (LFE) (Zaxis Inc.). Corresponding to the fractions LDL1 to LDL6 with increasing density from the UC-analysis the LDL fraction of the LFE was divided into 6 subfractions. Because the Rs-differences between these LDL1 to LDL6 subfractions within the LDL-fraction are small, it is necessary to take as a standard a mixture of UC-LDL1 and UC-LDL6 and place it at both sides of each analytical lane with a sample of native patient serum. For correlation of the LFE main serum fraction we took the mean of the two Rs-values of the neighbouring standard lanes. Yet, as an essential prerequisite and a basis of our procedure we could show that LDL-fractions 1 to 6 are placed separately on lanes forming peaks in the same order as the UC- LDL fractions, giving an appearance like a staircase. In this work we compared LDL subfractions in samples of 82 patient sera separated by LFE with the same ones separated by UC. As a basis for determination of the UC-LDL main fraction were used the Apolipoprotein B (ApoB)- or Cholesterol (Chol)-values, measured in each fraction separately. In 28 samples (ApoB), no main fraction could be found, but nearly equal amounts of ApoB- and Chol-values in the subfractions. As UC main fraction we took only those with AopB- or Chol-values > 23%, > 25% and > 27%, resp. Using a cut-off of 23% ApoB we found an agreement with the main peak of the LFE in 56% of the samples (cut-off > 25%: 61% correlation; cut-off > 27%: 64% correlation). Forming only three subfractions, LDL1 and LDL2 together as less arteriogenic particles, LDL3 and LDL4 as a mean fraction and LDL5 and LDL6 together as highly arteriogenic particles, using a cut-off of 33% for each, we observed equivalence in 72% of the samples. The same procedure using Chol-values showed a similar tendency, but the correspondence between UC and LFE subfractions was lower. Electrophoretic separation of lipoproteins on polyacrylamide gels, starting with untreated samples of native sera, yields in relative short time a profile of lipids by separation into VLDL, IDL, LDL, and HDL fractions and subfractions, resp. When worked out carefully, LFE provides LDL subfractions with comparable precision to UC. Yet, LFE is able to identify those patients which possess normal values for LDL-Chol and HDL-Chol, and normal total Chol/LDL-Chol-quotients, respectively, but live in danger to develop endothelial dysfunction or arteriosclerosis because their LDL profile is unhealthy. They can be brought under medical attendance to a moderate prevention (change of lifestyle, healthy food, weight reduction, physical exercises). For high risk patients it should be of major importance to test variations by lipid reducing substances by monitoring the LDL profile, especially for reducing small dense LDL. For this goal, extensive clinical studies would be required.
Analyse der Low-Density-Lipoproteine (LDL) : kann die LFE die UZ-Fraktionierung von LDL ersetzen? ; Lipoprotein electrophoresis and ultracentrifugation for LDL subfraction analysis
Knothe, Ingrid (author)
2005-01-01
Theses
Electronic Resource
German
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